Как оптимизировать методы ВЭЖХ для лучшего разделения и точности

Техническое руководство для руководителей лабораторий, разработчиков методов и групп закупок ВЭЖХ

Лучшее разделение ВЭЖХ редко достигается за счет случайного изменения одной настройки. Начните с определения критической пары, требуемого предела отчетности и критериев приемки; затем проверьте селективность, органический состав, pH, скорость потока, нагрузку нагнетания и температуру в указанном порядке. Для рутинной работы часто легче перенести и проверить стабильный изократический метод. Когда соединения с поздним элюированием или широкий диапазон полярности увеличивают время анализа, градиент может быть оправдан. Практической целью является метод, который разрешает критические пики с повторяемыми удерживанием и площадью пика, оставаясь при этом в рамках ограничений давления, детектора, колонки и пробы вашего прибора.

1. Определите проблему разделения, прежде чем менять условия.

Запишите симптомы: совместное элюирование, образование хвостов, удерживание дрейфа, противодавление, слабый отклик или чрезмерное время работы. Определите пару пиков, которая имеет значение для решения о выпуске или исследовании. Улучшение незначительной примеси при принесении в жертву этой пары не является улучшением.

Установите измеримые цели: повторяемость удерживания, точность площади, разрешение критических пар, хвосты, пластины и время цикла. Запишите растворитель образца, концентрацию, объем ввода, размеры колонки, добавки и длину волны, чтобы можно было отделить изменения селективности от изменчивости препарата.

2. Сначала измените селективность: химический состав колонки, pH и органический растворитель.

Селективность обычно имеет больший эффект, чем небольшая регулировка расхода. Для обращенно-фазовых анализов сравните неподвижные фазы с контролируемыми размерами и размером частиц. C18 — это полезная отправная точка, а не универсальный ответ; для основных, кислотных и высокополярных аналитов может потребоваться другая фаза или система добавок.

Контролируйте pH с помощью определенного буфера и убедитесь, что конечный pH измерен в предполагаемом водном компоненте. Небольшие сдвиги pH могут изменить ионизацию аналита и, следовательно, удерживание и селективность. Поддерживайте постоянство концентрации буфера, порядка приготовления, фильтрации и хранения. Если в методе используются летучие добавки, перед сравнением результатов проверьте совместимость детектора и чистоту источника.

Проанализируйте идентичность растворителя и его пропорцию отдельно. Ацетонитрил и метанол могут проявлять разную селективность при одинаковой силе элюирования. Изменяйте один фактор за раз или используйте небольшой дизайн, а затем подтвердите результат с помощью свежей подвижной фазы. Более сильный растворитель может сократить пробег, но сжать критическую пару.

3. Сознательно выбирайте изократическую или градиентную операцию.

Используйте изократическое элюирование, когда образец имеет узкое окно удерживания и важна простота переноса. Постоянный состав упрощает уравновешивание и устранение неполадок. Градиентное элюирование помогает, когда ранние пики нуждаются в слабых условиях, а поздние соединения создают длинный хвост; он добавляет переменные объема задержки и повторного уравновешивания.

Для изократической работы оптимизируйте процент органических веществ вокруг критической пары и проверьте адекватное удержание первого пика. Для градиента определите исходный состав, скорость изменения, промывку и время повторного уравновешивания. Если объемы задержки в разных приборах различаются, сопоставьте время на входе колонки, а не копируйте только запрограммированную таблицу.

4. Настройте скорость потока и давление в пределах контролируемого окна.

Скорость потока влияет на эффективность, давление и время анализа. Начните с рекомендованного поставщиком колонки диапазона, затем протестируйте узкий диапазон от низкого до высокого, наблюдая за разрешением и противодавлением. Меньший расход может повысить эффективность в некоторых условиях, но удлиняет пробег; более высокий поток может увеличить пропускную способность, одновременно снижая эффективность или превышая предел давления. Относитесь к давлению как к жесткому рабочему ограничению, а не как к целевому показателю производительности.

ChroMini HPLC LC-80MI имеет диапазон скорости потока 0,001–5,000 мл/мин, точность измерения расхода <= +/-0,1% при заданных условиях испытания, точность измерения относительного отклонения <=0,5% и максимальное давление 5800 фунтов на квадратный дюйм. Эти опубликованные значения помогают определить окно скрининга на стороне прибора, но они не заменяют подтверждение того, что выбранная вами колонка, вязкость, температура и подвижная фаза остаются в безопасных пределах. Запишите давление при последнем методе, после уравновешивания и в чистой системе, чтобы было легче диагностировать будущий дрейф.

5. Сопоставьте впрыск, обнаружение и температуру с образцом.

Объем впрыска и сила растворителя могут привести к образованию фронтальных, расщепленных или искаженных ранних пиков. Если это возможно, держите растворитель пробы не более сильным, чем исходная подвижная фаза, уменьшите объем впрыска для перегруженных пиков и подтвердите концентрацию в соответствии с линейным рабочим диапазоном детектора. Подготовьте повторные флаконы из того же раствора перед изменением условий хроматографии; в противном случае изменчивость препарата может замаскироваться под проблему разделения.

Установите длину волны УФ-излучения на основании спектра аналита или проверенного метода, а не стандартного значения по умолчанию. Wincom LC-80MI имеет диапазон УФ-детектора 190–680 нм и точность длины волны +/- 1 нм и точность ниже 0,1 нм. Это полезные данные о приборе для планирования метода, хотя фактическая чувствительность по-прежнему зависит от поглощающей способности аналита, концентрации, состояния проточной ячейки и шума в целом методе.

Температура может стабилизировать вязкость и удерживание, но она не является автоматическим средством устранения плохой селективности. Термостатируемый отсек колонки для LC-80MI не является обязательным. Прежде чем указать его, подтвердите его диапазон, стабильность, данные калибровки и совместимость с вашей колонкой и подвижной фазой.

6. Проверьте оптимизированный метод, проверив пригодность и надежность системы.

После выбора условий запустите повторные стандартные инъекции или инъекции, соответствующие требованиям системы. Определите пределы перед просмотром результатов. Отслеживайте разрешение критических пар, повторяемость удерживания, точность площади, хвосты и количество тарелок. Введите бланк для переноса и репрезентативную матрицу для интерференции.

Проверьте надежность около заданного значения процентного содержания органических веществ, pH, расхода, температуры, длины волны и объема впрыска. Используйте реалистичные изменения и в первую очередь определите переменную, которая угрожает критическому результату. Документируйте партию колонки, подготовку подвижной фазы, уравновешивающий объем, конфигурацию и правила обработки.

⭐ Рекомендуемая компактная система ВЭЖХ | Wincom ChroMini ВЭЖХ LC-80MI

Наша ChroMini HPLC LC-80MI представляет собой изократическую систему «все в одном», объединяющую насос LC-80, детектор UV80, ручной инжектор 7725i, рабочую станцию ​​WS-80 и колонку C18 с внутренним диаметром 5 мкм 4,6×250 мм. Его конфигурация обеспечивает контроль расхода 0,001–5000 мл/мин, максимальное давление до 5800 фунтов на квадратный дюйм и УФ-обнаружение в диапазоне 190–680 нм.

Используйте Страница продукта ChroMini HPLC LC-80MI чтобы проверить указанную конфигурацию, затем отправьте нам названия аналитов, химический состав колонки, рецепт подвижной фазы, концентрацию, объем ввода, целевое разрешение и ожидаемую пропускную способность пробы через нашу страница контактов . Затем мы можем подтвердить, является ли опубликованная конфигурация подходящей отправной точкой, необходим ли дополнительный термостатируемый отсек колонки и какая документация или аксессуары должны быть включены в предложение.

Краткий обзор проверок оптимизации метода

Часто задаваемые вопросы:

Когда мне следует перейти от изократической к градиентной ВЭЖХ?

Переключайтесь, когда постоянный состав не может адекватно удерживать ранние соединения и элюировать поздние соединения за разумное время цикла или когда селективность во всем диапазоне образцов остается плохой. Если доминируют простота передачи и надежность рутинной работы, сохраняйте изократический метод там, где он соответствует целевому значению критической пары. Мы можем рассмотреть предлагаемый градиент с учетом размеров вашей колонки, объема выдержки и требований к повторному уравновешиванию через Категория оборудования для ВЭЖХ .

Может ли LC-80MI поддерживать метод, требующий обнаружения УФ-излучения с длиной волны менее 200 нм?

Опубликованный диапазон UV80 составляет 190–680 нм, поэтому метод, требующий длины волны в этом интервале, находится в пределах заявленного диапазона детектора. Подтвердите реакцию аналита, поглощение подвижной фазы, условия проточной ячейки и приемлемость шума с помощью теста на пригодность системы, прежде чем считать метод валидированным. См. Технические характеристики LC-80MI .

Подходит ли поставляемая колонка C18 для любого анализа ВЭЖХ?

Нет. Указанная колонка C18 5 мкм, 4,6×250 мм представляет собой определенную стартовую конфигурацию, а не доказательство универсальной совместимости аналитов. Укажите полярность аналита, pKa, матрицу, целевое разрешение и любые ограниченные растворители, чтобы мы могли подтвердить, подходит ли поставленная колонка или следует указать другую стационарную фазу. Начните с ассортимент лабораторного оборудования и включите эти условия в свой запрос.